膀胱癌(BC)是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，全球每年约有430,000例新增病例和165,100例死亡。BCSCs具有高度致瘤性、耐药性和转移性，其典型生物标志物为67LR、CD44、细胞角蛋白5 (CK5)和CD90/ CK14。尽管Van Batavia等人提供了小鼠尿路上皮癌祖细胞的遗传证据，但人类BCSCs 的遗传状态和起源在很大程度上尚不明确。

为了进一步了解人BCSCs的遗传基础和系统发育状态，我们从3个BC标本中分离出BCSCs(CD31-CD45-CD44+)、BCNSCs (CD31-CD45-CD44-)、BESCs(pan-CK+CD44+)和BENSCs(pan-CK+CD44-)。值得注意的是，BCSCs和BCNSCs可在NOD/SCID小鼠中形成肿瘤，但BESCs和BENSCs在异种移植实验中失败。此外，与BCNSCs和BENSCs相比，BSCSs和BESCs表现出自我更新和球体形成的能力，并且干细胞相关基因的表达水平上调。最后，在有限稀释的异种移植和系列移植试验中，BCSCs在引发膀胱癌方面优于BCNSCs。综上所述，前四种类型的膀胱癌细胞和正常膀胱组织细胞的收集和分选方法是适用和可靠的。

为了说明人BC细胞的层次结构，我们从3个BC标本中分离59个细胞，通过多重位移扩增(Multiple Displacement Amplification, MDA)建立文库，并在外显子组区域进行平均深度为43.6×的外显子组测序。此后，我们从单个细胞中收集SNPs，并过滤掉在所有细胞中一致或仅在单个细胞中出现的位点。利用每位患者所有细胞中确定的28649、29879和36313个多态性SNP/SNV位点，基于改进的邻居连接(NJ)方法进行系统发育分析，评估细胞的克隆性。在这个过程中，我们选择了BESC作为外群体来评估BESC、BENSC、BCSC和BCNSC的进化关系，有趣的是，结果表明BCSCs可能起源于BESC的突变(P1和P3)，也可能起源于BCNSCs的改变(P2)。

我们在P1、P2和P3分别检测到757、499和166个体细胞突变。筛选dbSNP和同义突变后，鉴定出406个非同义突变基因。总的来说，在所有单细胞DNA中选择了200个基因的突变进行验证，97.22%(1188/1222)的预测突变得到确认。为了证明BCSCs的关键基因突变，我们通过功能和突变频率筛选了所有406个非同义突变基因。发现21个关键基因突变，主要分布在细胞周期调控(TP53、STAG2、ATM和CREBBP)、转录调控(BRF1、PAWR、SIN3A、ERCC2、MKL1、TP53和ETS1)、染色质重塑(ARID1A、CREBBP和MLL2)、细胞分化和自我更新(FAT4和GPRC5A)等5条功能通路上。具体而言，六个基因(ETS1, GPRC5A, MKL1, PAWR, PITX2和RGS9BP)以前未被报道为BC中的关键改变基因。此外，与BCNSCs相比，BCSCs显示出更高的非同义突变频率，这强调了特定突变对BCSCs干细胞获得的关键作用。然而，在BCNSCs和BCSCs 中，以C/G>T/A和A/T>G/A为主的基因突变谱保持相同。然后，我们重点研究了BCSCs中具有转录调控、染色质重塑和自我更新功能的改变基因。因此，我们从21个突变基因中选出19个，从中选出15个突变率超过50%的基因作为进一步功能研究的候选基因。

为了验证BCSCs特异性突变的功能，我们使用CRISPR/ Cas9将个体突变引入从原代BC样本分离的BCSCs中。在15个突变中，只有MLL2略微增强了BCNSCs的球形形成。先前的研究表明，BCNSCs可能需要多次突变才能显著提高生成球体的能力。接下来，我们用MLL2突变和其余14个基因突变分别联合感染BCNSCs。MLL2与ARID1A、CREBBP或GPRC5A共转染增强了BCNSCs的成球能力，其中MLL2与ARID1A联合转染效果最好。因此，我们继续逐步实验，从剩下的13个基因突变中加入第三个基因突变。结果表明，GPRC5A的加入显著提高了BCNSCs的成球能力，与分离的CD44+ BCSCs相当。基于MLL2+ARID1A+GPRC5A组合，任何第四个额外突变都没有显著增加球体形成能力。

与BCNSCs野生型细胞(BCNSCs WT)相比，ARID1A/GPRC5A/MLL2突变的BCNSCs (BCNSCs Mut)在ARID1A、GPRC5A和MLL2 mRNA表达水平上没有显著变化。值得注意的是，与BCNSCs WT相比，BCNSCs Mut表现出自我更新、球体形成和更高表达(300%)的干细胞相关基因。此外，BCNSCs Mut比BCNSCs WT形成更大的肿瘤(595%)。此外，限制性稀释异种移植和连续移植试验是评估癌症干细胞(CSCs)潜在的金标准。与BCNSCs WT相比，BCNSCs Mut具有更高的膀胱癌启动能力和系列肿瘤形成能力。综上所述，ARID1A、GPRC5A和MLL2的改变在BCNSCs的干性获得中发挥了至关重要的作用。

总之，本研究通过单细胞测序阐明了BCSCs的遗传基础和干细胞相关突变。首先，观察到BCSCs是由BESCs(P1和P3)或BCNSCs(P2)通过突变积累而形成的，这为CSCs起源的假设提供了遗传学证据。此外，我们在BCSCs中鉴定了21个关键改变基因，以及6个新的突变基因。最后，ARIDA1、GPRC5A和MLL2的共突变使BCNSCs具有干细胞性。我们的研究结果总体上表明了膀胱癌靶向治疗的新可能性。